Min/TafelWV

Anlage 2

(zu § 4 Abs. 3)

Mikrobiologische Untersuchungsverfahren

1
Escherichia coli und coliformen Keimen gemeinsam ist die Fähigkeit, bei einer Temperatur von 37 Grad +- 1 Grad C Laktose innerhalb von 20 +- 4 Stunden unter Gas- und Säurebildung abzubauen.
1.1
Die Untersuchung auf Escherichia coli in mindestens 250 Milliliter Wasser kann durch:
a)
Flüssiganreicherung in doppelt konzentrierter Laktosebouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C oder 42 Grad +- 0,5 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden (Beobachtungszeit und Bebrütung bis 44 +- 4 Stunden), oder
b)
Membranfiltration und Bebrütung des Membranfilters auf Laktose-Fuchsin-Sulfitagar (Endoagar), Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C oder 42 Grad +- 0,5 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden,
erfolgen.
Eine endgültige Diagnose ist durch das Stoffwechselmerkmal "Gas- und Säurebildung aus Laktose", bzw. Bildung von fuchsinroten Kolonien auf dem bebrüteten Membranfilter allein nicht möglich, so daß zusätzlich nach Sub- bzw. Reinkultur auf Endoagar mindestens folgende Stoffwechselmerkmale geprüft werden müssen:
Cytochromoxydasereaktion: negativ
Laktosevergärung: Gas- und Säurebildung bei 37 Grad +- 1 Grad C innerhalb 20 +- 4 Stunden
Indolbildung aus tryptophanhaltiger Bouillon: positiv
Spaltung von Laktose, Dextrose oder Mannit bei 44 Grad +- 0,5 Grad C innerhalb von 20 +- 4 Stunden zu Gas und Säure: positiv.
Ausnutzung von Citrat als einziger Kohlenstoffquelle: negativ.
1.2
Die Untersuchung auf coliforme Keime in mindestens 250 Milliliter Wasser kann durch:
a)
Flüssiganreicherung in doppelt konzentrierter Laktosebouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden (Bebrütung und Beobachtungszeit bis 44 +- 4 Stunden), oder
b)
Membranfiltration und Bebrütung des Membranfilters auf Laktose-Fuchsin-Sulfitagar (Endoagar), Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden,
erfolgen.
Eine endgültige Diagnose ist durch das Stoffwechselmerkmal "Gas- und Säurebildung aus Laktose" bzw. durch die Bildung von fuchsinroten Kolonien auf dem bebrüteten Membranfilter nicht möglich, so daß zusätzlich nach Sub- bzw. Reinkultur auf Endoagar mindestens folgende Stoffwechselmerkmale geprüft werden müssen:
Cytochromoxydasereaktion: negativ
Laktosevergärung: Gas- und Säurebildung bei 37 Grad +- 1 Grad C nach 44 +- 4 Stunden
Indolbildung aus tryptophanhaltiger Bouillon:
in der Regel negativ (positive Reaktion möglich)
Spaltung von Dextrose, Laktose oder Mannit zu Gas und Säure bei 44 Grad +- 0,05 Grad C innerhalb von 20 +- 4 Stunden: in der Regel negativ (positive Reaktion möglich)
Ausnutzung von Citrat als einziger Kohlenstoffquelle: positiv oder negativ
Coliforme Keime spalten also in jedem Falle Laktose bei 37 Grad +- 1 Grad C unter Gas- und Säurebildung, weichen aber in der Indolbildung und/oder im Zuckerabbau bei einer Bebrütungstemperatur von 44 Grad +- 0,5 Grad C und/oder im Citratabbau von den für Escherichia coli genannten Merkmalen ab.
2
Die Untersuchung auf Faekalstreptokokken kann durch:
a)
Flüssiganreicherung in doppelt konzentrierter Azid-Dextrose-Bouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden (Beobachtungszeit und Bebrütung bis 44 +- 4 Stunden), oder
b)
Membranfiltration und Bebrütung des Membranfilters entweder auf Tetrazolium-Natriumazid-Agar, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden oder in einfach konzentrierter Azid-Dextrose-Bouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden (Beobachtungszeit und Bebrütung bis 44 +- 4 Stunden)
erfolgen.
Die endgültige Diagnose ist durch Wachstum in Azid-Dextrose-Bouillon oder auf Tetrazolium-Natriumazid-Agar nicht möglich, so daß zusätzlich nach Sub- und Reinkultur auf Blutagar mindestens folgende Merkmale geprüft werden müssen:
Aesculinabbau:
positiv nach Verimpfen in Aesculinbouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit mindestens 40 +- 4 Stunden, Farbreaktion mit frischer 7%iger wäßriger Lösung von Eisen-II-Chlorid
Wachstum bei pH 9,6:
positiv nach Verimpfen in Nährbouillon pH 9,6, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden
Wachstum bei 6,5%igem Kochsalzzusatz:
positiv nach Verimpfen in Nährbouillon mit 6,5% Kochsalzzusatz, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden.
3
Die Untersuchung auf Pseudomonas aeruginosa kann durch
a)
Flüssiganreicherung in doppelt konzentrierter Malachitgrünbouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden (Beobachtungszeit und Bebrütungszeit bis 44 +- 4 Stunden), oder
b)
Membranfiltration und Bebrütung des Membranfilters in einfach konzentrierter Malachitgrünbouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden (Beobachtungszeit und Bebrütungszeit bis 44 +- 4 Stunden),
erfolgen.
Die endgültige Diagnose ist durch Wachstum in Malachitgrünbouillon nicht möglich, so daß zusätzlich nach Sub- und Reinkultur auf Laktose-Fuchsin-Sulfitagar (Endoagar) oder einen anderen geeigneten Selektivagar mindestens folgende Stoffwechselmerkmale geprüft werden müssen:
Bildung von Fluorescein:
positiv nach Verimpfen auf das Medium nach King (B) F, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 44 +- 4 Stunden
und Bildung von Pyocyanin:
positiv nach Verimpfen auf das Medium nach King (A) P, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 44 +- 4 Stunden
oder Bildung von Ammoniak aus Acetamid:
positiv nach Verimpfen auf (ammoniumfreie) Acetamid-Standard-Mineralsalzlösung, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden, positive Reaktion mit Nessler's Reagenz.
4
Die Untersuchung auf sulfitreduzierende, sporenbildende Anaerobier kann durch
a)
Membranfiltration und Bebrütung des Membranfilters unter einer Schicht von Dextrose-Eisensulfat-Natriumsulfitagar, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden, Beobachtung für weitere 20 +- 4 Stunden, Auszählung der schwarzen Kolonien, oder
b)
Flüssiganreicherung in 50 ml doppelt konzentrierter Dextrose-Eisencitrat-Natriumsulfit-Bouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad +- 1 Grad C, Bebrütungszeit 20 +- 4 Stunden, Beobachtung für weitere 20 +- 4 Stunden, positiv bei Schwärzung des Flüssignährbodens,
erfolgen.
5
Bestimmung der Koloniezahl
Als Koloniezahl wird die Zahl der mit 6- bis 8facher Lupenvergrößerung sichtbaren Kolonien bezeichnet, die sich aus den in 1 ml des zu untersuchenden Wassers befindlichen Bakterien in Plattengußkulturen mit nährstoffreichen, peptonhaltigen Nährböden (1% Fleischextrakt, 1% Pepton) bei einer Bebrütungstemperatur von 20 Grad +- 2 Grad C nach 44 +- 4 Stunden oder bei einer Bebrütungstemperatur von 37 Grad +- 1 Grad C nach 20 +- 4 Stunden Bebrütungszeit bilden.
Die verschiedenen bei der Bestimmung verwendeten Nährböden unterscheiden sich hauptsächlich durch das Verfestigungsmittel, so daß folgende Methoden möglich sind:
5.1
Gelatinenährboden, Bebrütungstemperatur 20 Grad +- 2 Grad C,
5.2
Agarnährboden, Bebrütungstemperatur 20 Grad +- 2 Grad C, oder 37 Grad +- 1 Grad C,
5.3
Kieselsäure-Phosphatbouillon-Nährboden, Bebrütungstemperatur 20 Grad +- 2 Grad C oder 37 Grad +- 1 Grad C.
6
Werden bei den Untersuchungen nach Nummer 1.2 und 2 bis 5 Ergebnisse erzielt, die auf eine Überschreitung der festgelegten Grenzwerte hindeuten, so ist an mindestens 4 weiteren Proben festzustellen, daß die Grenzwerte im Wasser nicht überschritten werden.